兴奋剂检测

在体育比赛中，有些运动员为了争取取得好名次、提高成绩，常服用一些药物，企图凭借药物作用获得荣誉。这种做法损害了体育运动的本来目的，也违反了奥林匹克公平竞赛的原则。同时，因药物的毒副作用严重地威胁着运动员的身体健康，国际奥委会（IOC）明文规定禁止运动员服用某些药物，并自1968年起在奥运会比赛中对运动员进行“滥用药物”的检测，若查出他已服用，便立即取消其参赛资格及所得名次。由于最早服用的药物多为兴奋性药物——刺激剂类，所以尽管以后也禁用了其他类型的药物，但在我国则常常将所有的禁用药物统称为“兴奋剂”，有关的检测工作则统称为“兴奋剂检测”。正确的叫法应为“滥用药物”及“滥用药物检测”，分别对应于英文“doping”和“doping control”。为方便起见，本文仍使用“兴奋剂”一词，即包括所有的禁用的滥用药物。　  一 服用药物历史 在竞赛中服用各种物质以求获得优势的做法已有多年历史。早在公元前600年，古罗马的斗士就使用过刺激剂。公元前3世纪，希腊人也曾服用过蘑菇以求提高成绩。19世纪80年代在法国的自行车600km比赛中发生过运动员因服用药物而死亡。1910年已开始对参赛马匹的唾液进行药物检查。在1960年，罗马奥运会上发生了丹麦自行车运动员Kurt EnemarKnud Jensen因服用苯丙胺类而死亡的事件。在1967年，环法自行车赛中英国的运动员Tommy Simpson也因服用苯丙胺药物而丧生。这些事件促使了国际奥委会医学委员会对1968年第19届奥运会开始实行药物检查。当时禁用的药物只有8种，检测方法是气相色谱（氢焰离子化检测器）法和薄层色谱法等。1972年第20届奥运会时，禁用药物增加至26种，检测仪器采用气相色谱-氮磷检测器。1976年，又增加了甾体同化激素一类5种禁用药物，使用气相色谱-质谱联用仪器。1980年公布的禁用药物为58种，开始采用毛细管气相色谱法检测。其后1984年增至69种。1988年再增加β-阻断剂和利尿剂类药物，总数达100种。1991年增加一类多肽，1994年12月IOC公布的禁用药物共分为七类，计108种。有关历届奥运会检测运动员数目及阳性结果列于表1。 表1　 历届奥运会的药物检测结果 *其中1金牌，1银牌，2铜牌子　 **其中3金牌，1铜牌 二 禁用药物 1995年禁用的药物，按其性质可分为7类（见表2），分述如下： 表2禁用药品名单（1994，12） 注意：该表并非禁用物质的详尽无遗的一览表。仅向读者提供一个较为综合的禁用物质一览表，于该扩展表中没有出现的许多物质按“及相关物质”术语被认为禁用。 　    1.刺激剂 这类药物共有41种。它们通过神经系统的作用，增强人的精神与体力。其副作用是导致过度兴奋与焦虑，进一步影响判断力而容易受伤，心率及血压会急速上升，有可能造成脱水、脑溢血及心脏病发作。上述两例运动员的死亡就是服用这类药物引起的。这类药物中含咖啡因，奥委会规定尿中咖啡因含量超过12μg/ml才算违禁。 2.麻醉剂 这类药物共有10种。服用后可产生痛快感及心理亢奋，并能降低痛感，以致在参赛中造成更严重的伤害。这类药物多有成瘾性，会引起很多生理及心理问题。 3.合成类固醇及β2激动剂 这类药物共27种。合成类固醇又称甾体同化激素，是雄性激素衍生物。这类药物具有增长肌肉的作用，为很多运动员口服或注射使用，但副作用也很严重，会干扰人体的自然激素平衡，男人服用后会发生抑制雄性激素分泌，睾丸缩小，胸部扩大，早秃等现象；女人服用后，会发生男性化，肌肉增生，月经失调，毛发增多等现象。有些作用还是不可逆的。过多地使用这类药物还会引起严重的肝、肾损伤、并发肝癌及心脏病症等。这类药物中的睾酮是人体自然分泌的一种激素，所以规定要测定睾酮与其异构体表睾酮之比值，大于6时可判断为使用了此类药物。另有几种β2激动剂，据认为也有类似作用。 4.β-阻断剂 这类药物共有12种。原为降低血压和降低心率的药物，但同时具有镇静作用。对于射击、射箭等项目的运动员，稳定神经，提高成绩。 5.利尿剂 共13种。这类药物会促进排尿，使尿液变稀，使禁用药物在尿中的浓度减小而不易查出。还可使体重下降，因此在一些有体重限制的比赛项目中常有运动员服用。 6.遮蔽剂 共2种。表睾酮是因为使用后可使睾酮与表睾酮的比值变小，从而遮蔽了睾酮的违禁使用。另一药物丙磺舒则在服用后可抑制合成类固醇类药物在尿中的排出，因而使此类药物在尿中的浓度降低，可能不被检出。 7.肽类激素 共4种。都是内源性激素，使用后或可起到雄性激素作用，或可增加身体耐力，因而也被禁用。 禁用药物除去上述这些品种外，还包括结构和性质与这些药物相似的物质，所以实际禁用药物决不限于已列出的这些，会大大超过这个数目。这些类似的药物都做为“有关化合物”，也是禁用的，是为了防止运动员取巧，服用新发明的某些药物。　  检测手续 兴奋剂检测都是通过尿样的分析来进行的。被检查的运动员一般是获得了名次的，对未获名次的则是随机选择。比赛结束后一个小时内，被选中的运动员需去取样站报到，有专人伴随左右，直至取得尿样为止。一般需取尿样至少75ml，分装两个瓶内，一瓶装约50ml，称为A样，另一瓶装25ml，称为B样。将A样与B样密封、编号，再装入一个袋中，密封，冷冻保存，送往检测中心分析。在分析时，先用A样进行，应在24小时内得出结果，如查出尿样中有禁用药物，则由检测中心通知组织委员会，再通知运动员及其所在体育队队长、队医。大家会同当面取出B样再进行分析复审，如仍检测出有禁用药物，则由医学委员会讨论决定采取措施。 由于服用药物影响运动员的声誉，所以检测工作要求极严格，并采取严密的保安措施，以防止各种弄虚作假的欺骗行为。　  四 检测实验室的资格 对检测兴奋剂的实验室，国际奥委会有一套规定的申请手续与方法，经测试合格后，才有资格进行这项工作，其所发出的分析结果报告才被认为有效。现在的规定是：如欲承担某国际性比赛的兴奋剂检测，必须在比赛前一年通过正式考试，而在参加正式考试前的半年至一年内，要先通过3次预考试。每次考试须分析10个未知尿，并在24小时内得出正确结果。如有一个不正确，须重新补做2个未知样品并得出正确结果。如只做对7个考试尿样，则作不及格论，须过一年后再行申请考试。 考试合格的实验室的有效工作期限为一年，翌年初须进行复核。复核时要分析8个未知尿样，并得出正确结果，做错1个时，可补加2个未知样品。如上所述，如复核不能通过，则该实验室的检测资格即被取消。 国际奥委会医学委员会对申请兴奋剂检测资格考试的实验室首先要对其人员组成、业务能力、过去成就、实验室设备、所用兴奋剂检测方法、禁用药物标准品、禁用药物阳性尿、原型药物和必要的代谢物的气相色谱和质谱数据等等进行审查，认为合格后才同意其申请。较困难的是标准品的收集和阳性尿的取得，因为禁用药物是世界各地生产的、需通过多种渠道才能收集完全；有些药物还需要特殊许可才可携带或运输邮寄。阳性尿的取得则要有自愿服用这些药物的人按时收集尿液，作为检测时的对照标准。除了用运动员的尿样分析结果来确证其是否服用某药物外，同时要有此药物的标准品、阳性尿和空白尿的色谱和质谱图谱，共同对照比较。当尿样与标准品和阳性尿的数据完全相同时才可确证。　 五 检测步骤 尿样由专人送至检测实验室后，需登记、编号，并测量某些基本数据，如pH、比重、颜色、体积及有无沉淀等。然后将尿样分取数份，按组进行筛选，若筛选中查出有违禁药物，则需进一步确证其存在。 色谱方法是较理想的检测手段。1967年报道的刺激剂系统检测方法分为三步：第一步为筛选，第二、三步为确证。用两种提取方法以气相色谱法（GC）、薄层色谱法（TLC）进行分离鉴定，使用了4种GC填充柱系统，氢焰离子化检测器，可检出40种兴奋剂。其后随着色谱技术的发展及禁用药物的增加，检测方法也相应地不断改进。1972年采用了程序升温方法，并用氮磷检测器检测。1976年使用气相色谱-质谱联用手段检测甾体，1980年开始用毛细管气相色谱法检测，至1984年大体基本定型，并增加了用高效液相色谱法检查几种特定药物及咖啡因定量等工作。1988年增加了2类药物，β-阻断剂多用气相色谱法检出，利尿剂则用高效液相色谱法检测。目前一般按兴奋剂类别分为4组或5组进行。各实验室所用方法的原理大同小异，具体试验条件则根据自己的具体情况而有所不同。检测的第一步是筛选，如未查出任何禁用药物即做为阴性尿，不再考虑；如查出有禁用药物存在，则仍需进一步分析，称为“确证”。现以我们在第十一届亚运会所用的检测方法为例，说明如下： 1.筛选方法 尿样送到试验室后，分别取数毫升放小试管内，分交各组进行筛选实验。共分为：挥发性含氮化合物组、难挥发含氮化合物组、利尿剂及特殊结构化合物组、甾体同化激素组。 （1）挥发性含氮化合物组 主要检测刺激剂。这类药物多以游离形式排出，其检测流程如图1，所用气相色谱条件列于表3。 （2）难挥发含氮化合物组 主要检测麻醉镇痛剂和β-阻断剂。这两类药物多以结合形式排出，因此需先水解，使之游离，再进行衍生化后检测，其方法流程如图2，色谱条件如表4所示。 

表3气相色谱操作条件

表4 气相色谱操作条件

（3）利尿剂组药物经提取后用高效液相色谱法分析检测，此组同时检测2种兴奋剂，咖啡因和匹莫林，检测程序和色谱条件分别见图3和表5。

表5　 液相色谱操作条件

（4）甾体同化激素组 此类药物有的以游离形式，有的以结合形式排出，我们所用的方法为同时检测。其流程和色谱条件如图4和表6所示。

表6 气-质联用操作条件

2.确证方法 经筛选判为阳性的尿样，需进一步加以确证，根据规定，确证结果须给出药物或其代谢物的质谱图，因此在确证方法中均使用气相色谱-质谱联用仪，确证时的分组同筛选方法中所述。 （1）挥发性含氮化合物组方法同筛选，最后之提取物浓缩后进样于GC/MSD。色谱条件见表7。 表7　 气-质联用操作条件    （2）难挥发含氮化合物组方法同筛选，最后之衍生化产物取小量进样于GC/MSD。色谱条件见表8。 表8　 气-质联用操作条件    （3）利尿剂组此组药物需衍生化，然后进样于GC/MSD。方法见图5（a，b）色谱条件见表9。 表9气-质联用操作条件    （4）甾体同化激素组 方法均同筛选，唯最后得出全质谱图作为确证。 现代的兴奋剂检测实验室多采用自动化程度较高的仪器，并由计算机控制，可以自动进样，提高准确性和重现性，并可编制检测程序，大大方便了此项工作。 需要提出的是禁用药物中的肽类激素药物是1990年以后才提出的，目前还没有很好的检测方法，同时因为它们都是人体内的内源性物质，在分析方法和数据积累、限量等方面还需要做更多的工作才能订出较合适的标准。　  六　 我国的兴奋剂检测工作 为迎接1990年第十一届亚运会在北京召开和承担运动员尿样的检测工作，于1986年9月由中国医学科学院药物研究所和国家体委体育科学研究所协作，共同筹建我国的兴奋剂检测中心。经过三年的努力，1989年3月开始，接受了IOC医学委员会兴奋剂和体育生化分委会的三次预考和两次水平考试，共38个未知尿样均获得了准确结果，顺利通过。于1989年11月正式考试，分析10个未知尿样，又按时得出全部正确结果，同年12月8日，IOC副主席、IOC医学委员会主席Alexandre de Merode亲王写信给中国兴奋剂检测中心，正式通知确认其为合格的兴奋剂检测实验室。因此我国成为当时世界上第20个、亚洲第3个合格的实验室，可以独立承担各种运动比赛的兴奋剂检测工作。此后每年复试也都合格，一直保持了此资格。现在该检测中心设在国家体委运动医学研究所内。